気 の 強い 女 エロ — シングル セル トランス クリプ トーム
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2.ハイスループット解析用のマイクロ流路系の開発 膨大な数のライブラリー株をレーザー顕微鏡によりハイスループットで解析するため,ソフトリソグラフィー技術を用いてシリコン成型したマイクロ流体チップを開発した 6) ( 図1b ).このチップは平行に並んだ96のサンプル流路により構成されており,マルチチャネルピペッターを用いてそれぞれに異なるライブラリー株を注入することによって,96のライブラリー株を並列的に2次元配列することができる.チップの底面は薄型カバーガラスになっているためレーザー顕微鏡による高開口数での観察が可能であり,3次元電動ステージを用いてスキャンすることにより多サンプル連続解析が可能となった.チップの3次元スキャン,自動フォーカス,光路の切替え,画像撮影,画像分析など,解析の一連の流れをコンピューターで完全自動化することにより,それぞれのライブラリー株あたり,25秒間に平均4000個の細胞の解析を行うことができた. 3.タンパク質発現数の全ゲノム分布 解析により得られるライブラリー株の位相差像と蛍光像の代表例を表す( 図1c ).それぞれの細胞におけるタンパク質発現量が蛍光量として検出できると同時に,タンパク質の細胞内局在(膜局在,細胞質局在,DNA局在など)を観察することができた.それぞれの細胞に内在している蛍光に対して単一蛍光分子による規格化を行い,さらに,細胞の自家蛍光による影響を差し引くことによって,それぞれの細胞におけるタンパク質発現数の分布を決定した( 図1d ).同時に,画像解析によって蛍光分子の細胞内局在(細胞質局在と細胞膜局在との比,点状の局在)をスコア化した( 図1e ). この結果,大腸菌のそれぞれの遺伝子の1細胞あたりの平均発現量は,10 -1 個/細胞から10 4 個/細胞まで,5オーダーにわたって幅広く分布していることがわかった.必須遺伝子の大半が10個/細胞以上の高い発現レベルを示したのに対し,全体ではおおよそ半数の遺伝子が10個/細胞以下の発現レベルを示した.低発現を示すタンパク質のなかには実際に機能していることが示されているものも多く存在しており,これらのタンパク質は10個以下の低分子数でも細胞内で十分に機能することがわかった.このことは,単一細胞レベルの微生物学において,単一分子感度の実験が本質的でありうることを示唆する.
単一の生細胞におけるプロテオームとトランスクリプトームとを単一分子検出感度で定量化する : ライフサイエンス 新着論文レビュー
2019年1月15日 / 最終更新日: 2019年4月1日 ad_ma ニュース 当研究室にシングルセルトランスクリプトーム解析装置BD Rhapsody systemが導入されました。 松島研究室では独自の高感度whole-transcirptomeライブラリ増幅法をRhapsodyシステムに適用することにより、SMART-Seq2と同等の感度を有する包括的single-cell RNA-seq解析を実施しています。
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4.タンパク質数分布の普遍的な構造 それぞれの細胞におけるタンパク質数の分布を調べたところ,一般に,低発現数を示すタンパク質の分布は単調減少関数,高発現数を示すタンパク質の分布はピークをもった関数になっていた.さまざまなモデルを用いてフィッティングを行い,すべての遺伝子の分布を一般的に記述できる最良の関数を探した結果,1018遺伝子のうち1009遺伝子をガンマ分布によって記述できることをみつけた.大腸菌はガンマ分布というゲノムに共通の構造にそってプロテオームの多様性を生み出しており,その分布はガンマ分布のもつ2つのパラメーターによって一般的に記述できることが明らかになった. このガンマ分布は,mRNAの転写とタンパク質の翻訳,mRNAの分解とタンパク質の分解が,それぞれ確率的に起こると仮定した場合のタンパク質数の分布に等しい 7) ( 図2 ).これはつまり,タンパク質数の分布がセントラルドグマの過程の確率的な特性により決定づけられることを示唆している.そこで以降,このガンマ分布を軸として,細胞のタンパク質量を正しく記述するためのモデルをさらに検証した. シングルセル解析と機械学習により心不全において心筋細胞が肥大化・不全化するメカニズム（心筋リモデリング機構）を解明 | 国立研究開発法人日本医療研究開発機構. 5.タンパク質数のノイズの極限 タンパク質数の分布のばらつきの大きさ,または,ノイズ(発現数の標準偏差の2乗と発現数の平均の2乗の比と定義される)は,個々の細胞におけるタンパク質量の多様性を表す重要なパラメーターである 3) .このノイズをそれぞれの遺伝子について求めたところ,つぎに示すような発現量の大きさに応じた二相性のあることをみつけた. 平均発現数が10分子以下の遺伝子は,ほぼすべてがポアソンノイズを下限とする,発現数と反比例した量のノイズをもっていた.このポアソンノイズは一種の量子ノイズであり,遺伝子発現が純粋にランダムに(すなわち,ポアソン過程で)行われた場合のノイズ量を表している.つまり今回の結果は,タンパク質発現のノイズをポアソンノイズ以下に抑えるような遺伝子制御機構は存在しないことを示唆する.実際のノイズがポアソンノイズを上まわるということは,遺伝子の発現が準ランダムに行われていることを表している.実際,ひとつひとつのタンパク質の発現は純粋なランダムではなく,mRNAの発現とともに突発的に複数のタンパク質の発現(バースト)が起こり,mRNAの分解と同時にタンパク質の発現がとまる,といったかたちでバースト的に行われることが報告されている 1) .筆者らは,複数のライブラリー株をリアルタイム計測することでバーストの観測を行うことにより,バーストの頻度と大きさが細胞集団計測で得られるノイズの大きさに合致することをみつけた.これはつまり,ノイズの大きさがmRNAバーストの性質により決定されていることを表している.
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シングルセル解析と機械学習により心不全において心筋細胞が肥大化・不全化するメカニズム（心筋リモデリング機構）を解明 | 国立研究開発法人日本医療研究開発機構
8.mRNAプロファイリング つぎに,タンパク質発現の中間産物であるmRNAの量を単一分子感度・単一細胞分解能でプロファイリングすることを試みた.そのために,蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)法を用いて,ライブラリーの黄色蛍光タンパク質のmRNAに赤色蛍光ヌクレオチドを選択的にハイブリダイゼーションした.この方法ではすべてのライブラリーに対して同じプローブを用いるため,遺伝子ごとのバイアスがほとんどない.レーザー顕微鏡を用いて細胞内の蛍光ヌクレオチドを数えることにより,mRNA数の決定を行った. mRNA数のノイズを調べた結果,タンパク質の場合とは異なり,ポアソンノイズにもとづくノイズ極限だけがみられた.これは,mRNAの数は少ないためにポアソンノイズが大きくなり,一様なノイズ極限の影響が現われなくなったためであると考えられた. 9.mRNAレベルとタンパク質レベルとの非相関性 赤色蛍光ヌクレオチドと黄色蛍光タンパク質の蛍光スペクトルが異なることを利用して,単一細胞におけるmRNA数とタンパク質数を同時に測定しその相関を調べた.137の遺伝子に対して測定を行ったところ,どの遺伝子においてもこれらのあいだには強い相関はなかった.つまり,単一細胞においては内在するmRNA数とタンパク質数とのあいだには相関のないことが判明した. この非相関性のおもな理由としてmRNAの分解時間の速さがあげられる.RNA-seq法を用いてmRNAの分解時定数を調べたところ,数分以下であった.これに対し,ほとんどのタンパク質の分解時定数は数時間以上であり,タンパク質数の減衰はおもに細胞分裂による希釈効果により起こることが知られている 9) .したがって,mRNAの数は数分以内に起こった現象を反映するのに対し,タンパク質の数は細胞分裂の時間スケール(150分)のあいだで積み重なった現象を反映することになり,これらの数のあいだに不一致が起こるものと考えられる. 単一細胞におけるmRNA量の高ノイズ性を示す今回の結果は,1細胞レベルでのトランスクリプトーム解析に対してひとつの警告をあたえるものであり,同時に,プロテオーム解析の必要性を表している. 10.1分子・1細胞レベルでの発現特性と生物学的機能との相関 得られた1分子・1細胞レベルでの発現特性が生物学的な機能とどのように相関しているかを統計的に調べた.たとえば,タンパク質発現平均数はコドン使用頻度の指標であるCAI(codon adaptation index)と正の相関をもつのに対し,GC含量やmRNAの分解時間,染色体上の位置との相関はなかった.また,膜トランスポーターの遺伝子は高い膜局在性,転写因子は高い点局在性を示した.また,短い遺伝子は高いタンパク質発現を示すことや,リーディング鎖にある遺伝子からの転写はラギング鎖にある遺伝子からの転写よりも多いことがわかった.さらに,大腸菌のノイズは出芽酵母のノイズと比べ高いことも明らかになった 10) .
Nature, 441, 840-846 (2006)[ PubMed] 著者プロフィール 略歴:2006年 大阪大学大学院基礎工学研究科博士課程 修了,同年より米国Harvard大学 ポストドクトラルフェロー. 専門分野:生物物理学,ナノバイオロジー. キーワード:1分子・1細胞生物学,システム生物学,プロテオミクス,超高感度顕微鏡技術,微細加工技術,生命反応の物理,生物ゆらぎ. 抱負:顕微鏡工学,マイクロ工学,遺伝子工学,コンピューター工学など,さまざまな分野にまたがるさまざまな要素技術を組み合わせて,生命を理解するための新しい画期的な技術をつくるのが仕事です.生物学,物理学,統計学などのあらゆる立場から生命活動の本質を理解し,人々の疾病克服,健康増進に役立てることが目標です. © 2010 谷口 雄一 Licensed under CC 表示 2. 1 日本
J. Mach. Learn. Res. 2008)。 (注9)WGCNA(Weighted Gene Co-expression Network Analysis、重み付け遺伝子共発現ネットワーク解析): データセットから共発現遺伝子ネットワークを抽出し、そのネットワークモジュールごとに発現値を付与する機械学習解析アルゴリズム(Langfelder, P et al.